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數(shù)字 PCR 技術(shù)的原理和優(yōu)勢

數(shù)字 PCR 技術(shù)的原理和優(yōu)勢如下:

原理


數(shù)字 PCR 是將含有核酸分子的熒光 PCR 反應(yīng)體系隨機分散到成千上萬個單獨的納升級反應(yīng)器中,每個反應(yīng)器或不含待檢核酸靶分子,或含有至少一個待檢核酸靶分子1。其過程主要包括以下步驟:

  1. 分散體系:將樣本充分稀釋并分配到多個獨立的反應(yīng)單元中,如基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字 PCR 會通過油包裹 PCR 體系形成無數(shù)個油包水微滴,每個微滴是一個獨立反應(yīng)單元;基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字 PCR 則利用微流控芯片裝置使 PCR 反應(yīng)體系準確快速地分散于芯片孔中。
  2. PCR 擴增:在每個反應(yīng)單元中進行單獨、平行的 PCR 反應(yīng),對目標核酸分子進行擴增。
  3. 信號檢測:擴增結(jié)束后,對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析,有熒光信號的反應(yīng)器判讀為 “1”,沒有熒光信號的反應(yīng)器判讀為 “0”,從而將熒光模擬信號數(shù)字化,最終根據(jù)泊松分布原理以及陰 / 陽性反應(yīng)的比例,直接計算反應(yīng)體系中待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度。

優(yōu)勢


  1. 絕對定量:常規(guī) PCR 和實時熒光 PCR 定量檢測需已知拷貝數(shù)的標準 DNA 制定標準曲線,會因樣品測定條件差異造成 PCR 擴增效率不同,影響定量結(jié)果準確性。而數(shù)字 PCR 不受標準曲線和擴增動力學影響,可直接讀出 DNA 的分子個數(shù),實現(xiàn)絕對定量。
  2. 高靈敏度:能檢測到極低拷貝數(shù)的核酸分子,原則上最低可檢測到 1 個拷貝的靶標分子,可有效區(qū)分與監(jiān)測微量濃度變化,能精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品,比如可以檢測出體細胞中含量極低的單個突變,能識別低至 1/100,000 的變異頻率1。
  3. 高耐受性:目的序列被分配到多個微滴或反應(yīng)單元中,顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對反應(yīng)的干擾,擴增基質(zhì)效應(yīng)大大減小,對樣品的純度要求相對沒那么苛刻,在檢測復(fù)雜樣本或含有抑制劑的樣本時更具優(yōu)勢。
  4. 樣品需求量低:在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯優(yōu)勢,只需少量的樣本即可進行檢測,能夠節(jié)約珍貴的生物樣本。
  5. 可進行多重檢測:多個單一的反應(yīng)單元為多目標序列的高通量檢測提供了基礎(chǔ),可同時對多個目標核酸分子進行檢測和分析,提高檢測效率和信息獲取量。
  6. 結(jié)果準確性和重復(fù)性好:由于每個反應(yīng)單元獨立進行反應(yīng)和檢測,減少了反應(yīng)之間的干擾和誤差,使得檢測結(jié)果的準確性和重復(fù)性更高,不同批次實驗之間的差異也較小。
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